实验干货：细胞瞬转质粒详细步骤，从准备到转染一步不落

一、细胞瞬时转染（脂质体转染）

细胞瞬时转染是一种快速且高效的研究工具，广泛应用于基因功能研究、信号通路分析以及药物筛选等领域。脂质体转染作为一种经典的转染方法，因其操作简便、转染效率高且对细胞毒性相对较低而备受青睐。以下为详细的实验步骤：

1. 实验步骤

①细胞铺板

选择合适的细胞类型，并提前在六孔板上进行铺板操作，确保在转染时细胞的密度能够达到70% - 90%。这一密度范围是经过多次实验优化得出的最佳区间，细胞密度过低可能导致转染效率不佳，而密度过高则可能影响细胞的正常生长和代谢，进而干扰实验结果。在铺板过程中，还需注意细胞的均匀分布，以保证后续实验的准确性和可重复性。

②细胞状态观察与质粒准备

在进行转染之前，务必仔细观察细胞的生长状态。健康的细胞形态饱满，贴壁良好，无明显的细胞碎片和死亡细胞。只有处于良好生长状态的细胞，才能保证较高的转染效率和后续实验的成功率。根据实验目的和细胞类型，计算好所需的质粒体积。质粒的浓度和纯度对转染效果至关重要，因此在使用前需确保质粒经过严格的纯化处理，并在适当的保存条件下储存，以避免质粒降解或污染。

③转染复合物配置

转染复合物的配置是整个实验的关键步骤之一。通常使用Opti-MEM或无血清培养基来配置转染复合物。Opti-MEM是一种低血清培养基，能够为脂质体和质粒的混合提供一个稳定的环境，同时减少血清成分对转染过程的干扰。将适量的脂质体与质粒按照一定的比例混合后，轻轻混匀，使其充分反应形成转染复合物。随后将混合物置于室温下孵育15分钟。在这段时间内，脂质体与质粒会通过静电相互作用形成稳定的复合物，为后续的转染过程做好准备。

④细胞处理与转染复合物加入

在转染复合物孵育的同时，对六孔板中的细胞进行预处理。首先，小心弃去孔板中的旧培养基，注意避免对细胞造成过度的机械损伤。然后用PBS（磷酸盐缓冲液）轻轻洗涤细胞一遍，以去除残留的血清和杂质。洗涤完成后，加入1.5 - 1.8ml新鲜的无抗生素培养基。无抗生素培养基的使用是为了避免抗生素对转染复合物的吸附和细胞代谢的干扰。待转染复合物孵育完成后，将每孔细胞加入250μl转染复合物。加入时需注意操作的轻柔性，避免产生气泡，以免影响细胞的生长和转染效率。轻轻晃动孔板，使转染复合物均匀分布于细胞表面，确保每个细胞都能充分接触到转染复合物。

⑤后续培养与样本收集

完成转染操作后，将六孔板置于细胞培养箱中继续培养。细胞培养箱的温度、湿度和二氧化碳浓度等参数需严格控制，以模拟细胞在体内的生长环境，保证细胞的正常生长和代谢。在转染后24小时，可以根据实验需要提取细胞的RNA样本。RNA的提取可用于分析转染后基因的表达情况，如通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测目的基因的转录水平变化，从而评估转染效率和基因功能。而在转染后48 - 72小时，可以提取细胞的蛋白样本。蛋白的提取可用于检测目的蛋白的表达和功能，例如通过西方印迹（Western Blot）技术分析目的蛋白的合成、修饰以及与其他蛋白的相互作用等情况，进一步深入研究基因在细胞中的生物学功能。

2. 注意事项

（1）转染复合物配置

在配置转染复合物时，必须使用低血清的 Opti-MEM 基础培养基。Opti-MEM 是一种专为转染实验设计的培养基，其成分经过优化，能够为脂质体与质粒的结合提供理想的环境。血清中含有丰富的蛋白质，这些蛋白质可能会与脂质体或质粒发生非特异性结合，从而干扰转染复合物的形成，降低转染效率。因此，在配置转染复合物时，应严格避免使用含有血清的培养基，以确保转染复合物的稳定性和有效性。

（2）细胞培养基的选择

在细胞换液过程中，切勿使用含有抗生素的培养基。脂质体转染试剂（如 Lipofectamine 3000）能够增加细胞膜的通透性，使细胞更容易吸收外源物质。然而，这种通透性的增加也意味着抗生素可以更容易地进入细胞内部。一旦抗生素进入细胞，可能会对细胞的正常生理功能产生负面影响，降低细胞的活性，甚至导致细胞死亡。这不仅会影响细胞的生长状态，还会显著降低转染效率。因此，在转染期间，应使用无抗生素的培养基，以确保细胞的健康和转染的成功率。

（3）细胞代次的选择

细胞的代次对转染效率有着重要的影响。随着细胞代次的增加，细胞的生理状态和代谢特性可能会发生改变，从而影响其对转染复合物的摄取和处理能力。一般来说，复苏后的前几代细胞（通常为1 - 5代）是进行转染实验的最佳选择。这些细胞通常具有较高的活性、良好的生长状态和较低的基因突变率，能够更好地接受外源质粒的转染，并有效地表达目的基因。选择合适的细胞代次，可以显著提高转染效率，减少实验的重复次数，节省时间和资源。

（4）其他注意事项